文章來源：中草藥雜志社
? ? ? ? 尿酸（uric acid，UA）水平過高會(huì)增加痛風(fēng)、腎病及心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。高尿酸血癥的治療通常依賴于別嘌呤醇和非布司他等藥物，這些藥物通過抑制黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XO）活性來減少UA生成。然而這些藥物可能伴隨一些不良反應(yīng)，別嘌呤醇常導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)，如皮疹、瘙癢性丘疹、蕁麻疹和水皰性反應(yīng)等；非布司他常導(dǎo)致肝功能異常，如肝功能衰竭和黃疸等[4]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找新的替代或補(bǔ)充治療藥物及其前體化合物十分必要。黃酮是一類廣泛存在于植物中的多酚類化合物，因其具有多種生物活性而備受關(guān)注。其中，黃酮類化合物在降低UA水平方面的潛力近年來引起了大量研究者的興趣。已有研究表明，一些黃酮類化合物可通過調(diào)節(jié)UA在腎臟的重吸收或抑制XO的活性發(fā)揮降UA作用[5]。已有研究表明艾葉提取物可降低高尿酸血癥小鼠UA水平[6]，但發(fā)揮藥效的活性成分未見報(bào)道。
? ? ? ? 本研究通過斑馬魚實(shí)驗(yàn)、分子對(duì)接和體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)等探究艾葉醇提物的降UA作用及發(fā)揮藥效的活性成分，旨在找到其發(fā)揮降UA作用的化學(xué)成分，為開發(fā)不良反應(yīng)更小的降UA天然藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1?材料
1.1? 動(dòng)物
? ? ? ? AB品系野生型斑馬魚由國(guó)家水生物種資源庫(kù)國(guó)家斑馬魚中心提供，養(yǎng)殖于本實(shí)驗(yàn)室循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)，環(huán)境溫度28 ℃，養(yǎng)殖用水pH 7.4，晝夜交替周期為14 h/10 h。
1.2? 藥品與試劑
? ? ? ? 艾葉購(gòu)于李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陳林霖研究員鑒定為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl. et Vant.的干燥葉。金合歡素（批號(hào)PS011043，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、澤蘭黃酮（批號(hào)PS011078，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%）購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司；槲皮素（批號(hào)100081-200907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；山柰酚（批號(hào)H1817030，質(zhì)量分?jǐn)?shù)97%）、芹菜素（批號(hào)L1927042，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、木犀草素（批號(hào)L1807023，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、氧嗪酸鉀（批號(hào)K2228489，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%）、別嘌醇（批號(hào)C2215368，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、黃嘌呤（批號(hào)L2107070，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%）、UA（批號(hào)L2215157，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；黃嘌呤氧化酶（批號(hào)C14951018）購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；總超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)091323240207）、活性氧檢測(cè)試劑盒（批號(hào)080923240115）及脂質(zhì)氧化丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)090423231215）購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司； XO比色法測(cè)試盒（批號(hào)WA238VV09710）購(gòu)于武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。
1.3?儀器
? ? ? ? Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀、柱溫箱、DAD檢測(cè)器及變色龍色譜在線分析軟件 [賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；CNW Athena C18-WP色譜柱（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）；WD-9415B型超聲清洗器（北京市六一儀器廠）；AB135-S型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多儀器公司）；PURELAB Ulitra超純水系統(tǒng) [威立雅（中國(guó)）環(huán)境服務(wù)有限公司]；KZ-II型高速組織研磨儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；N60 Implen型紫外分光光度計(jì)（北京諾匯誠(chéng)科技有限公司）。
2? 方法
2.1? 艾葉醇提物的制備及總黃酮含量測(cè)定
2.1.1? 艾葉醇提物的制備?艾葉粉碎后過2號(hào)篩，取10 g艾葉粉末，加100 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇回流提取1 h，靜置至室溫后濾出醇提液，再次加入100 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇回流提取1 h，濾過后合并濾液，將濾液濃縮至10 mL，即得到質(zhì)量濃度為1 g/mL的艾葉醇提物。
2.1.2?總黃酮含量測(cè)定? 參考文獻(xiàn)方法[7]使用《中國(guó)藥典》2020年版鋁鹽顯色法測(cè)定艾葉醇提物中總黃酮含量。
2.2? 艾葉醇提物對(duì)斑馬魚的作用研究
2.2.1? 斑馬魚最大耐受濃度（maximum talerated concentration，MTC）的測(cè)定? 隨機(jī)選取90尾受精后5 d（5 day post fertilization，5 dpf）的野生型AB品系斑馬魚，將斑馬魚轉(zhuǎn)入24孔板中，15尾/孔。用養(yǎng)魚用水配制質(zhì)量濃度分別為250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL（以艾葉生藥量計(jì)，下同）的艾葉醇提物溶液，除對(duì)照組外其余各孔分別加入艾葉醇提物2 mL，對(duì)照組加入2 mL養(yǎng)魚用水，28 ℃處理3 d，根據(jù)斑馬魚狀態(tài)及死亡率確定MTC。
2.2.2? 斑馬魚的分組、造模及給藥 ?5 dpf野生型AB品系斑馬魚隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、陽(yáng)性藥（136 μg/mL）組及艾葉低、中、高（250、500、1 000 μg/mL）劑量組。除對(duì)照組外，其余各組均使用含250 μmol/L氧嗪酸鉀和10 μmol/L黃嘌呤的養(yǎng)魚水進(jìn)行造模。陽(yáng)性藥組在養(yǎng)魚水中給予別嘌呤醇，艾葉低、中、高劑量組分別在養(yǎng)魚水中給予相應(yīng)艾葉醇提物，對(duì)照組給予等量養(yǎng)魚用水[8-9]。24 h后收集各組斑馬魚于EP管中，加PBS清洗3遍，吸干PBS后稱定質(zhì)量并將斑馬魚保存于?80 ℃?zhèn)溆谩?/p>
2.2.3?HPLC檢測(cè)斑馬魚UA水平?每組取適量斑馬魚并稱定質(zhì)量，加入200 μL PBS后經(jīng)組織研磨儀勻漿，15 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清，測(cè)定UA水平。色譜條件參考文獻(xiàn)方法[10]并稍作優(yōu)化，使用Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.9 mm，5 μm），流動(dòng)相為pH 2.5乙酸水（A）-5%甲醇（B）；0～12 min，5% B；進(jìn)樣體積20 μL；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)294 nm。采用PBS配制UA質(zhì)量濃度分別為5、10、15、20、25 μg/mL的系列對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣，以樣品質(zhì)量濃度（p）為橫坐標(biāo)、色譜峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A＝1.530 5 p＋0.938 9（r＝0.999 8）。以樣品峰面積計(jì)算UA濃度，并計(jì)斑馬魚體內(nèi)UA水平。
斑馬魚體內(nèi)UA水平＝(UA濃度×PBS體積)/(斑馬魚質(zhì)量)
2.2.4?斑馬魚氧化應(yīng)激水平的測(cè)定? 按照“2.2.2”項(xiàng)方法處理斑馬魚，按照試劑盒說明書測(cè)定各組斑馬魚MDA、ROS水平及SOD活性。
2.2.5? 斑馬魚XO活性的測(cè)定? 按照“2.2.2”項(xiàng)方法處理斑馬魚，按照試劑盒說明書測(cè)定各組斑馬魚體內(nèi)XO活性。
2.3? 艾葉黃酮與XO的分子對(duì)接
? ? ? ? XO的X-ray晶體三維結(jié)構(gòu)文件來源于RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[11]。該結(jié)構(gòu)包含6個(gè)配體，其中FAD和MOS為XO催化黃嘌呤羥基化必要配體[12]，保留這些配體并刪除其余配體，去掉靶蛋白的水分子并進(jìn)行加氫、加電荷和計(jì)算電荷。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)[13]檢索收集艾葉中存在的黃酮類成分，用swissADME數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)所有化合物的ADME性質(zhì)，根據(jù)Lipinski類藥性五原則篩選出33種候選黃酮，在pubchem中下載黃酮類成分結(jié)構(gòu)。選擇MO和FAD 2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接[11]。其中MO中心對(duì)接盒子的中心坐標(biāo)為21.229、13.900、117.409，盒子的大小為40×40×40個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)大小為0.037 5 nm。FAD中心對(duì)接盒子的中心坐標(biāo)為31.449、53.456、99.022，盒子的大小為40×58×40個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)，每個(gè)網(wǎng)格點(diǎn)大小為0.508 nm。設(shè)置參數(shù)后運(yùn)行vina進(jìn)行半柔性對(duì)接。
2.4?艾葉黃酮對(duì)XO抑制率的測(cè)定
2.4.1? 酶促反應(yīng)體系的建立?反應(yīng)體系以黃嘌呤為底物，在適宜條件下XO可將黃嘌呤催化為UA，加入各黃酮類成分后反應(yīng)一定時(shí)間，以反應(yīng)終止時(shí)體系中黃嘌呤的濃度計(jì)算相應(yīng)黃酮的XO抑制率。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定酶促反應(yīng)體系中XO終濃度為5 U/L，底物黃嘌呤終濃度為0.40 mmol/L，黃酮類成分濃度分別為0.05、0.10、0.20 mmol/L，反應(yīng)溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為60 min。
2.4.2? 色譜條件及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立? 參考文獻(xiàn)方法[14]稍作優(yōu)化，使用Athena C18-WP色譜柱（250 mm×4.9 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.02 mol/L磷酸二氫鉀溶液（A）-5%甲醇（B）；0～18 min，5% B；進(jìn)樣體積20 μL；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。采用PBS配制黃嘌呤濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L的系列對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下進(jìn)樣，以p為橫坐標(biāo)、A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A＝167.42 p＋0.452 6（r＝0.999 8）。
2.4.3?艾葉黃酮對(duì)XO抑制率的測(cè)定? 取100 μL 50 U/L的XO溶液于24孔板中，各給藥組分別加入50、100、200 μL的別嘌呤醇、木犀草素、金合歡素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮和芹菜素（1 mmol/L）的對(duì)照品溶液，對(duì)照組加入等體積PBS，37 ℃孵育15 min。加入400 μL的黃嘌呤溶液（1 mmol/L）啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃孵育60 min后，加入500 μL HCl（1 mol/L）終止反應(yīng)。將反應(yīng)溶液定容至2 mL，進(jìn)樣檢測(cè)黃嘌呤濃度，計(jì)算XO抑制率。
2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
利用GraphPad prism 10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析。
3?結(jié)果
3.1?艾葉醇提物總黃酮含量測(cè)定
艾葉醇提物中總黃酮質(zhì)量濃度為18.4 mg/mL。
3.2? 艾葉醇提物對(duì)斑馬魚的作用研究
3.2.1? 斑馬魚的MTC? 斑馬魚經(jīng)250、500、1 000、2 000、4 000 μg/mL艾葉醇提物藥浴處理3 d后，艾葉醇提物各劑量組死亡率依次為0、0、0、53.3%和93.3%。因此，斑馬魚的MTC為1 000 μg/mL，選擇250、500、1 000 μg/mL劑量作為低、中、高劑量。
3.2.2? 對(duì)斑馬魚UA水平的影響? 如圖1所示，與對(duì)照組比較，模型組UA水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性藥組及艾葉醇提物中、高劑量組UA水平顯著降低（P＜0.05、0.01），提示艾葉醇提物能顯著降低高尿酸血癥斑馬魚體內(nèi)的UA水平。
3.2.3?斑馬魚氧化應(yīng)激水平的測(cè)定? 如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚MDA水平顯著升高（P＜0.001），SOD活力顯著降低（P＜0.001）；與模型組比較，艾葉醇提物低、中、高劑量組MDA水平顯著降低（P＜0.001），SOD活力顯著升高（P＜0.05、0.01、0.001）。如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組斑馬魚ROS水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，艾葉醇提物低、中、高劑量組ROS水平顯著降低（P＜0.05、0.01、0.001）。結(jié)果表明，艾葉醇提物能夠促進(jìn)高尿酸血癥斑馬魚的氧化還原平衡，改善斑馬魚機(jī)體的氧化應(yīng)激狀態(tài)。其原因可能是模型組斑馬魚由于UA水平升高而使氧化應(yīng)激反應(yīng)加劇[15]，經(jīng)艾葉醇提物處理后，斑馬魚UA水平降低，從而改善了氧化應(yīng)激狀態(tài)。
3.2.4 ?斑馬魚XO活性的測(cè)定?如圖4所示，與對(duì)照組比較，艾葉低、中、高劑量組斑馬魚XO活性均顯著降低（P＜0.01），推測(cè)艾葉醇提物可能通過抑制斑馬魚XO活性，從而抑制UA的生成。
3.3?分子對(duì)接
3.3.1? 準(zhǔn)確性驗(yàn)證?使用pymol軟件將XO中的原始配體FAD提取出來，根據(jù)“2.3”項(xiàng)下方法將FAD與去除FAD的XO進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果見圖5。用pymol計(jì)算對(duì)接后的配體分子與原配體分子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）＝0.845。用同樣方法將水楊酸與XO的MO中心進(jìn)行對(duì)接，對(duì)接后的配體分子與原配體分子的RMSD＝0.000，表明該方法參數(shù)設(shè)置合理，程序適用，可用于后續(xù)黃酮類化合物的分子對(duì)接。
3.3.2? 艾葉黃酮與XO的分子對(duì)接?艾葉黃酮與XO的FAD和MO中心對(duì)接的最低結(jié)合能、關(guān)鍵氫鍵和π-π相互作用見表1。在XO的MO中心，ARG-880、GLU-802、PHE-914和PHE-1009是XO催化黃嘌呤生成UA過程中的關(guān)鍵氨基酸。艾葉黃酮化學(xué)成分，如木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、棕矢車菊素、異澤蘭黃素、茵陳色原酮、高車前素、6-甲基苜蓿素和芹菜素等均能與這些關(guān)鍵氨基酸結(jié)合，這說明以上化學(xué)成分可能競(jìng)爭(zhēng)黃嘌呤與XO的結(jié)合位點(diǎn)來抑制XO的催化反應(yīng)。FAD主要負(fù)責(zé)黃嘌呤羥基化反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移，分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)牡荊素、圣草酚、木犀草素、6-甲基苜蓿素、棕矢車菊素、異澤蘭黃素、矢車菊黃素和蔓荊子黃素等黃酮能與FAD形成氫鍵，因此推測(cè)以上化學(xué)成分可能通過抑制UA生成反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移過程來抑制UA生成。
? ? ? ? 根據(jù)結(jié)合能大小篩選出低于所有黃酮結(jié)合能均值的黃酮，再根據(jù)與關(guān)鍵氨基酸形成相互作用力的數(shù)量篩選出可能具有較強(qiáng)XO抑制活性的化合物。木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素和金合歡素在MO中心和FAD中心的結(jié)合能均低于其他化學(xué)成分，且能與XO形成至少3個(gè)及以上的關(guān)鍵作用力。推測(cè)木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素和金合歡素具有較好的抑制XO活性，各化學(xué)成分與XO的MO中心結(jié)合模式見圖6。
3.4? 艾葉黃酮對(duì)XO抑制率的測(cè)定
? ? ? ? 如圖7所示，在相同濃度下木犀草素與陽(yáng)性藥別嘌呤醇具有相近的XO抑制率，而槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素也具有抑制XO活性，且抑制作用呈濃度相關(guān)性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示艾葉黃酮降UA作用的機(jī)制可能與抑制XO活性相關(guān)，而主要發(fā)揮XO抑制活性的黃酮類化學(xué)成分可能為木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮及芹菜素，而金合歡素對(duì)XO的抑制率較低且不呈劑量相關(guān)，其原因有待進(jìn)一步探討。
4? 討論
? ? ? ? 本研究表明UA水平升高可能破壞氧化還原平衡，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)。艾葉醇提物可以降低UA生成，同時(shí)改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，該結(jié)果與研究報(bào)道結(jié)果一致[6]。本研究在明確藥效的基礎(chǔ)上，開展了艾葉醇提物降UA的機(jī)制研究。通過測(cè)定各組斑馬魚XO活性發(fā)現(xiàn)艾葉醇提物可能通過抑制XO活性達(dá)到降UA作用。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物中的黃酮類化合物均有抑制XO活性的作用[5]，因此，利用分子對(duì)接技術(shù)模擬了艾葉中各黃酮與XO的結(jié)合情況。分子對(duì)接結(jié)果解釋了艾葉醇提物發(fā)揮降UA作用的機(jī)制。XO中有2個(gè) [2Fe-2S] 簇中心、1個(gè)FAD中心和1個(gè)MO中心，其中MO中心負(fù)責(zé)與黃嘌呤結(jié)合并發(fā)生羥基化反應(yīng)，[2Fe-2S] 簇中心和FAD中心負(fù)責(zé)反應(yīng)后的電子轉(zhuǎn)移。在MO中心，ARG-880和GLU-802能夠穩(wěn)定反應(yīng)中間體；PHE-914和PHE-1009形成夾心狀占據(jù)底物黃嘌呤的芳香環(huán)，并通過強(qiáng)烈的π-π堆積作用穩(wěn)定黃嘌呤，其對(duì)黃嘌呤與XO的識(shí)別有關(guān)鍵作用[16-18]。FAD主要負(fù)責(zé)黃嘌呤羥基化反應(yīng)后的電子轉(zhuǎn)移，黃嘌呤在MO中心被轉(zhuǎn)化為UA后將產(chǎn)生1個(gè)電子，該電子經(jīng) [2Fe-2S] 轉(zhuǎn)移至FAD中心，并經(jīng)FAD轉(zhuǎn)移至超氧陰離子及過氧化氫中，若黃酮占據(jù)FAD中心，則可能影響黃嘌呤羥基化反應(yīng)后的電子轉(zhuǎn)移及超氧陰離子和過氧化氫的生成，進(jìn)而阻斷UA的生成反應(yīng)[19]。根據(jù)各黃酮在XO的MO和FAD 2個(gè)關(guān)鍵活性位點(diǎn)的結(jié)合能及與關(guān)鍵氨基酸形成作用力的數(shù)量，從33種黃酮中篩選出可能具有較高抑制活性的黃酮，并通過體外實(shí)驗(yàn)了進(jìn)一步驗(yàn)證了分子對(duì)接的結(jié)論。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素均能抑制XO的活性，且具有劑量相關(guān)性。其中，木犀草素的抑制率接近同等濃度的別嘌呤醇，這與研究報(bào)道結(jié)果相似[20]。
綜上，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明了艾葉醇提物具有降UA作用，通過分子對(duì)接及XO抑制率實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)揮降UA作用的主要成分為黃酮類化合物。分子對(duì)接研究發(fā)現(xiàn)艾葉中黃酮類化合物可能通過競(jìng)爭(zhēng)黃嘌呤結(jié)合位點(diǎn)或影響反應(yīng)的電子轉(zhuǎn)移過程而抑制XO活性，進(jìn)而影響UA的生物合成。通過體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)木犀草素、槲皮素、山柰酚、澤蘭黃酮、芹菜素在一定濃度下均能抑制XO活性，推斷其可能為發(fā)揮降UA作用的關(guān)鍵化學(xué)成分。本研究系統(tǒng)闡述了艾葉醇提物的降UA作用、機(jī)制及物質(zhì)基礎(chǔ)，為研發(fā)降UA藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
利益沖突?所有作者均聲明不存在利益沖突
