文章來(lái)源：半夏 藥靶孺子牛
值得注意的，今年 6月，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院湯其群教授團(tuán)隊(duì)在Science（IF=56.9）也發(fā)表過(guò)一篇青蒿素及其衍生物的文章“Artemisinins ameliorate polycystic ovarian syndrome by mediating LONP1-CYP11A1 interaction”，發(fā)現(xiàn)青蒿素類衍生物能夠顯著改善PCOS的疾病表型。機(jī)制上，青蒿素能夠靶向線粒體蛋白酶LONP1，促進(jìn)LONP1與其底物CYP11A1的結(jié)合，加速CYP11A1的降解，抑制卵巢雄激素的合成，降低PCOS患者的雄激素水平，改善月經(jīng)周期及卵巢多囊樣變。該研究證明青蒿素還可以緩解多種嚙齒動(dòng)物模型和人類患者中多囊卵巢綜合征的內(nèi)分泌表現(xiàn)。感興趣的朋友可一起關(guān)注一下。
2024年10月16日，斯坦福大學(xué)科學(xué)團(tuán)隊(duì)在Cell（IF=45.5）發(fā)表了題為“Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target”的文章，開(kāi)發(fā)了新的高通量多維度藥物篩選技術(shù)，從約5000個(gè)化合物中找到了治療心臟纖維化的破局新藥—青蒿琥酯（Artesunate，ART）。機(jī)制上，青蒿琥酯以MD2為靶點(diǎn)，能夠有效抑制心臟成纖維細(xì)胞中的纖維化基因表達(dá)，抑制其增殖、遷移和收縮，減少膠原蛋白沉積，改善心衰小鼠心臟功能。
1、多尺度藥物篩選鑒定抗纖維化化合物
作者首先建立了一個(gè)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）為基礎(chǔ)的多尺度藥物發(fā)現(xiàn)平臺(tái)，從iPSC中獲得對(duì)纖維化刺激敏感的iPSC-CF，以ACTA2為標(biāo)志檢測(cè)MyoFB的激活。通過(guò)對(duì)約5000個(gè)化合物進(jìn)行了2次獨(dú)立的高通量篩選，每個(gè)化合物測(cè)試7個(gè)不同劑量，并隨后對(duì)iPSC衍生的心肌細(xì)胞（CM）和內(nèi)皮細(xì)胞（EC）進(jìn)行反篩選，排除具有潛在心血管毒性的化合物。
通過(guò)上述HTS和反篩選，青蒿琥酯（ART）成為了首選候選藥物，EC50為2.1 mM，對(duì)ipsccm或iPSC-ECs無(wú)毒性達(dá)10 mM。隨后作者驗(yàn)證了其在人原發(fā)性CFs中的抗纖維化作用，ART治療抑制了TGF-b1刺激下ACTA2和COL1A1的表達(dá)。此外，毒性測(cè)試顯示ART并沒(méi)有顯著損害原代CFs的活力、iPSC-CMs的活力和收縮力，以及原代ECs的活力和一氧化氮的產(chǎn)生。這些結(jié)果共同證明了ART治療心臟纖維化的潛在療效和安全性（圖1）。
圖1 多尺度藥物篩選鑒定抗纖維化化合物
2、ART抑制CFs和3d – EHT中MyoFB的激活
然后，作者進(jìn)行了一系列功能研究，以全面評(píng)估抗ART治療的抗纖維化作用。在多種促纖維化因子（血管緊張素II、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子、白細(xì)胞介素11、血小板衍生生長(zhǎng)因子bb、TGF-b1、tenascin-C和內(nèi)皮素-1）誘導(dǎo)的iPSC-CF模型和心臟纖維化患者體內(nèi)分離的MyoFB中，青蒿琥酯都能有效地抑制MyoFB增殖和膠原分泌。此外，青蒿琥酯同時(shí)具有預(yù)防和治療效果。總的來(lái)說(shuō)，結(jié)果表明ART抑制iPSC-CFs、人原發(fā)CFs、人患病心肌病MyoFBs和3D eht的纖維化（圖2）。
圖2?青蒿琥酯抑制心肌成纖維細(xì)胞和工程心臟組織的肌成纖維細(xì)胞活化
3、在心衰和心肌梗死的臨床前小鼠模型中，ART可減輕纖維化并改善心功能
接著，研究利用采用小鼠主動(dòng)脈縮窄術(shù)（TAC）用以模擬心臟肥厚早期階段的纖維化，發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯治療可顯著減少心肌中的膠原沉積和MyoFB標(biāo)記基因表達(dá)，青改善了TAC導(dǎo)致的心衰相關(guān)心臟功能障礙。此外，在缺血再灌注（IR）模擬心肌梗死的小鼠模型中，青蒿琥酯同樣能顯著改善心功能（圖3）。
圖3 在心力衰竭小鼠模型中，青蒿琥酯可減輕纖維化并改善心功能
4、ART抑制TAC誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞群體的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化
為了揭示TAC模型中ART治療后CF轉(zhuǎn)分化的動(dòng)態(tài)，作者使用103xGenomics平臺(tái)對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行了單核RNA測(cè)序（snRNA-seq）： sham， TAC組（TAC）和TAC+ART處理組。snRNA-seq的無(wú)監(jiān)督聚類鑒定出多個(gè)心臟細(xì)胞簇，包括CFs、CMs、ECs、巨噬細(xì)胞和周細(xì)胞。成纖維細(xì)胞簇的差異表達(dá)基因（DEG）分析顯示，有161個(gè)tac上調(diào)基因被ART顯著抑制，如Col1a1、Col1a2、Col3a1、Postn、Eln、Sparc、Fbn1和Loxl1。GO和KEGG通路分析表明，這些基因主要參與纖維化的發(fā)展，如TGF-b信號(hào)傳導(dǎo)、ECM組織、膠原形成和膜-ECM相互作用（圖4）。
圖4 青蒿琥酯抑制TAC誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞群體的動(dòng)態(tài)變化
5、ART可抑制cf中的纖維化基因和通路
接下來(lái)，作者研究了在CFs中ART調(diào)控的細(xì)胞信號(hào)。在TGF-b1或IL-11刺激下，ART以劑量依賴性的方式抑制健康供體人原代CFs中的關(guān)鍵MyoFB標(biāo)記物和ecm，包括ACTA2、COL1A1、POSTN、纖維連接蛋白（FN1）和CTGF。ART也抑制了人患病心肌病myofb中這些纖維化基因的表達(dá)。為了全面描述轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化，作者對(duì)6個(gè)獨(dú)立品系中經(jīng)載體和art處理的人原代CFs進(jìn)行了RNA測(cè)序，這些CFs有或沒(méi)有TGF-b1刺激。在所有TGF-b1刺激的基因中，有459個(gè)基因被ART顯著逆轉(zhuǎn)，包括ACTA2、COL1A1、COL1A2、TAGLN、SPARC、LOX、CDK1、E2F1和PLK1。GO和GSEA途徑分析顯示，ART下調(diào)了信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，包括ECM組織、膠原形成、增殖和遷移、平滑肌收縮和結(jié)締組織發(fā)育。
此外，作者還評(píng)估了ART對(duì)其他器官成纖維細(xì)胞的抗纖維化作用，觀察到ART抑制了從特發(fā)性肺纖維化（IPF）肺組織、瘢痕疙瘩皮膚組織和代謝功能障礙相關(guān)脂肪性肝炎（MASH）患者肝組織中分離的活化的人患病myofb中ACTA2和COL1A1的表達(dá)。這些結(jié)果表明，在外界促纖維化刺激下，ART可減弱人原代CFs中纖維化基因的表達(dá)和信號(hào)通路，并減輕各種纖維化疾病中來(lái)自不同器官的人患病myofb的激活（圖5）。
圖5 青蒿琥酯抑制纖維化基因和途徑
6、ART通過(guò)分子靶向MD2抑制MyoFB的激活
ART通過(guò)結(jié)合紅細(xì)胞中的血紅素產(chǎn)生活性氧（ROS），是治療瘧疾最有效的療法之一。作者注意到血紅素相關(guān)基因，包括HBA1、HBA2和HBB，在人類原發(fā)性CFs中不表達(dá)，這表明抗纖維化和抗瘧疾作用之間存在不同的機(jī)制。據(jù)報(bào)道，ART可抑制巨噬細(xì)胞中的toll樣受體4 （TLR4）信號(hào)傳導(dǎo)，然而，TLR4信號(hào)在cf中的作用以及ART如何調(diào)節(jié)TLR4通路尚不清楚。MD2是與TLR4相互作用的共受體，在配體如脂多糖（LPS）的刺激下形成信號(hào)受體。
作者觀察到LPS刺激了人原代CFs中纖維化基因（ACTA2, COL1A1， CTGF）的表達(dá)，表明MD2/TLR4的激活促進(jìn)了MyoFB的激活。為了評(píng)估MD2和TLR4在心臟纖維化中的作用，作者用siRNA沉默MD2或TLR4的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MD2或TLR4敲低均可通過(guò)TGF-b1刺激抑制人原發(fā)CFs的轉(zhuǎn)分化，并減弱人患病心肌病MyoFBs的激活。作者還測(cè)試了先前確定的已知抑制MD2/TLR4信號(hào)通路的化合物，包括TLR4抑制劑T5342126和TAK-242，以及MD2抑制劑L6H21。與基因敲低實(shí)驗(yàn)一致，這三種化合物都抑制MyoFB的激活，突出了通過(guò)藥理調(diào)節(jié)MD2/TLR4信號(hào)通路的抗纖維化作用。
然后，作者檢查了ART是否直接與MD2結(jié)合，通過(guò)表面等離子體共振（SPR）發(fā)現(xiàn)ART與MD2之間的結(jié)合，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)一步研究了相互作用，發(fā)現(xiàn)ART誘導(dǎo)的MD2構(gòu)象變化。ART穩(wěn)定了MD2中殘基80-88的結(jié)構(gòu)域，這需要MD2-TLR4結(jié)合的靈活性。因此，穩(wěn)定該結(jié)構(gòu)域會(huì)拮抗MD2-TLR4相互作用，從而抑制信號(hào)通路。進(jìn)一步作者通過(guò)Trp熒光測(cè)定證明ART在功能上誘導(dǎo)了MD2的構(gòu)象變化。
接著評(píng)估ART干擾LPS-MD2結(jié)合的能力，ART和L6H21在MD2中LPS結(jié)合位點(diǎn)占據(jù)了相當(dāng)大的空間，這表明ART和L6H21與LPS競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合MD2。
接著作者證實(shí)了ART對(duì)LPS MD2相互作用的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗作用，并發(fā)現(xiàn)ART以劑量依賴的方式取代生物素標(biāo)記的LPS（生物素-LPS）與MD2結(jié)合，比L6H21更有效，這意味著ART具有更強(qiáng)的抗纖維化活性。同樣，在TGFb1刺激的人原代CFs中，ART比L6H21更有效地抑制關(guān)鍵纖維化基因（ACTA2、COL1A1、CTGF）的表達(dá)?？偟膩?lái)說(shuō)，這些結(jié)果表明ART通過(guò)靶向MD2抑制MyoFB的激活（圖6）。
圖6 MD2被確定為青蒿素的分子靶點(diǎn)
7、青蒿琥酯可拮抗MD2-TLR4信號(hào)級(jí)聯(lián)
MD2是與TLR4相互作用的共受體，在配體刺激下形成信號(hào)受體。除了來(lái)自革蘭氏陰性菌的LPS外，損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）也可以刺激MD2/TLR4信號(hào)通路。特別是，ECM成分，如TNC和FN1，先前被確定為能夠激活MD2/TLR4。作者觀察到TNC和FN1在TGF-b1刺激的人原發(fā)CFs中上調(diào)和患病心肌病MyoFBs。重組TNC蛋白刺激了人原代CFs中纖維化基因的表達(dá)，ART抑制了纖維化基因的表達(dá)。
接下來(lái)，作者驗(yàn)證了ART抑制配體誘導(dǎo)的MD2-TLR4復(fù)合物形成的假設(shè)。采用PLA和coIP來(lái)檢測(cè)過(guò)表達(dá)MD2/TLR4的HEK細(xì)胞和人原代CFs之間的生物化學(xué)相互作用，發(fā)現(xiàn)ART顯著抑制了MD2-TLR4的相互作用。
ERK是MD2/TLR4的主要下游信號(hào)通路之一，被報(bào)道為纖維化調(diào)控的重要模塊，作者發(fā)現(xiàn)ART抑制ERK活性。為了確定轉(zhuǎn)錄因子（TFs）通過(guò)MD2/TLR4信號(hào)控制由ART調(diào)節(jié)的纖維化基因表達(dá)，作者接下來(lái)在TGF-b1刺激后，在載體和ART處理的人原發(fā)CFs中進(jìn)行ATAC-seq測(cè)定，發(fā)現(xiàn)ART降低了tgf -b1誘導(dǎo)的染色質(zhì)可及性。ATAC-seq顯示ART抑制tgf -b1誘導(dǎo)的與纖維化高度相關(guān)的通路，包括ECM組織、傷口愈合和細(xì)胞骨架。
MAPK信號(hào)也被確定為下調(diào)的最高途徑之一，與ART通過(guò)MD2/TLR4途徑觀察到的ERK抑制（即MAPK家族）一致。此外，無(wú)監(jiān)督的基序富集分析顯示，激活蛋白-1 (AP1) TF家族是在TGF-b1刺激下ART下調(diào)最多的基序。作者驗(yàn)證了AP1家族的主要成分之一c-FOS 75在tgf -b1刺激的人原發(fā)CFs中被ART抑制。tac誘導(dǎo)的HF小鼠模型心臟組織中的ERK和c-FOS信號(hào)也被ART減弱?？傊?，研究結(jié)果表明，ART通過(guò)分子靶向MD2，抑制MD2和TLR4的相互作用，從而減弱細(xì)胞質(zhì)中的ERK和細(xì)胞核中的c-FOS，從而減少cf中纖維化基因的表達(dá)（圖7）。
圖7 青蒿琥酯可拮抗MD2-TLR4信號(hào)級(jí)聯(lián)
總結(jié)
圖8?青蒿琥酯靶向MD2蛋白治療心臟纖維化
